Stiri Online, Enciclopedie, Revista presei

Laborator de culturi de celule

in Biologie/Chimie

Designul unui laborator de culturi de celule

Este un deziderat a constitui un laborator de culturi de celule, pornind de la zero şi respectând norme precise, nefiind recomandată adaptarea unui laborator utilizat pentru alte scopuri.

Este de preferat ca sistemul de lucru să fie unitar şi toate manipulările să se efectueze într-un singur spaţiu (unitatea de procesare tisulară şi celulară) care trebuie să fie separat de zona de primire a materialului de studiu (zonă de carantină).

Spaţiul de lucru trebuie să fie steril, necesită o iluminare adecvată, un trafic aeric redus, suprafeţe de lucru uşor lavabile, o hotă de flux laminar şi lămpi de ultraviolete pentru sterilizare. Sticlăria trebuie să fie neutră, perfect transparentă, fără neregularităţi. Este reprezentată de sticlărie specială pentru culturi şi sticlărie uzuală de laborator.

Aparatură şi instrumentar:

Hotă microbiologică: asigură un mediu de lucru curat pentru produsele biologice şi protejează operatorul de aerosolii care pot conţine patogeni. Hota este dotată de obicei cu filtre HEPA (high efficiency particulate air). Aerul este recirculat prin sisteme complexe de filtre care respectă mediul extern.

Controlul microbiologic al contaminării se realizează cu ajutorul unor plăci speciale de agar care se amplasează în interiorul hotei pentru cel puţin 4 ore. Dacă pe suprafaţa acestor plăci nu cultivă nici bacterii nici fungi, înseamnă că mediul de lucru este propice din punct de vedere microbiologic. În funcţie de tipul de cultură intenţionat, se iau masuri specifice de asepsie, inclusiv împotriva unei eventuale contaminări virale.

Centrifuge: centrifugele sunt utilizate pentru tehnicile de rutină pentru subculturi pentru izolarea liniilor celulare sau pentru crioprezervarea celulelor izolate. Centrifugele produc în mod normal aerosoli; de aceea trebuie folosite tuburi de centrifugare sigilate, cu capac transparent care permite examinarea stării conţinutului înainte de desigilare. Se va verifica permanent echilibrarea centrifugii înainte de amorsare şi starea de coroziune; centrifuga va fi amplasată într-un loc accesibil.

Incubatoare: culturile celulare au nevoie de locaţii speciale pentru supravieţuire. Incubatoarele uzuale asigură condiţii de creştere constante, de temperatură, grad de umiditate şi nivele de CO2 atent controlate.

Temperaturile de lucru variază între 28°C (celule de la insecte) – 37°C (celule de la mamifere), iar nivelul de CO2 variază între 5-10%. La ora actuală există incubatoare cu nivele controlate de CO2 şi cu interior de Cu, care inhibă dezvoltarea germenilor. Totuşi, singura măsură care trebuie aplicată constant este igienizarea suprafeţelor şi volumelor de lucru.

Suprafaţa de lucru şi podelele: toate suprafeţele de lucru, podelele şi pereţii trebuie să fie netede şi uşor de curăţat, rezistente la apă şi la diferiţi reactivi (soluţii alcaline, acide, dezifectanţi). În zonele de congelare în azot lichid, podeaua trebuie să reziste la spargere iar geamurile trebuie să se închidă ermetic.

Instrumentar: bisturie, lame sterile, pense fine foarfeci chirurgicali. Dispozitivele de curăţare şi sterilizare includ: autoclave, un cuptor de sterilizare şi spălător de pipete. Totuşi, un laborator modern şi dotat financiar foloseşte materiale de lucru de unică utilizare, pentru reducerea la minim a posibilităţilor de contaminare.

Condiţii de cultură

Celulele de origine animală sunt destul de dificil de cultivat în raport cu cele bacteriene (excepţie fac celulele embrionare sau tumorale, care cultivă uşor). Pentru a permite supravieţuirea în condiţii de pseudonormalitate a celulelor sau fragmentelor de ţesut recoltate sunt necesare câteva condiţii esenţiale:

-temperatura de 37°C pentru celulele mamifere
-pH 7,2-7,4 şi o tărie ionică adecvată
-acces la nutrienţi care să simuleze cât mai precis mediul intern al organismului din care a fost extras fragmentul de ţesut

De obicei, celulele sau fragmentele de ţesut extrase sunt amplasate în vase speciale de cultură cu un mediu de cultură specific. Culturile sunt menţinute în incubatoare cu condiţiile menţionate mai sus şi controlate electronic.

Asepsia este una din condiţiile esenţiale pentru realizarea unei culturi tisulare sau celulare. Regulile care guvernează un spaţiu aseptic sunt:

-acces limitat la camera de culturi celulare, de obicei prin zonă ecluză

-suprafeţele de lucru se decontaminează înainte şi după utilizare

-manipularea probelor biologice se face numai cu instrumentar steril, eventual de unică utilizare şi semiautomatizat sau complet automatizat

-experimentatorul va purta echipament special şi mască de protecţie

-sterilitatea permanentă controlată a spaţiului de lucru

Mediile de cultură trebuie să asigure:

-echilibrul ionic obţinut cu ajutorul soluţiilor izotone (menţinerea presiunii osmotice);

-pH optim (7,2-7,4);

-temperatură optimă, conţinutul de O2 şi CO2 favorabile;

-elemente nutritive indispensabile metabolismului;

-evitarea contaminării cu germeni patogeni – se realizează prin adăugarea de antibiotic la mediul de cultură;

Clasificarea mediilor de cultură:

În funcţie de:

-consistenţă:
o lichide
o semilichide (mediu nutritiv + agar sau coagulat de plasmă sangvină)

-compoziţie:
o naturale
o semisintetice
o sintetice

-după valoarea nutritivă:
o medii de creştere (permit o proliferare celulară abundentă)
o medii de menţinere (care nu încurajează proliferarea dar menţin viabilitatea celulară

Compoziţia mediilor de cultură:

-serul – este un amestec complex de albumine, factori de creştere şi inhibitori ai acestora. Este un element esenţial al mediilor de cultură pe bază de ser. Cel mai folosit este serul fetal de viţel

-săruri anorganice: sunt necesare pentru menţinerea echilibrului osmotic şi reglarea potenţialului de membrană

-sisteme tampon, care sunt necesare pentru menţinerea pH-ului (tampon fosfat, tampon bicarbonat de sodiu şi CO2 – uşor de obţinut într-un incubator cu CO2, ieftin şi netoxic); în mediu există şi un indicator al pH-ului (roşu fenol care virează de la galben la roşu aprins şi apoi la violaceu);

-carbohidraţi: reprezintă sursa principală de energie pentru celule. Se utilizează în special medii cu glucoză, galactoză dar şi cele cu maltoză sau fructoză;

-vitamine: sunt prezente fie în ser (pentru mediile pe bază de ser) sau sunt adăugate în mediile artificiale. Cele mai importante vitamine pentru culturi celulare sunt cele din grupul B, necesare pentru creştere şi proliferare, riboflavina, tiamina şi biotina;

-proteinele şi peptidele sunt importante în mediile artificiale; includ albumina, transferina, fibronectina;

-lipide şi acizi graşi: importante pentru mediile artificiale, includ colesterolul şi steroizii;

-microelemente: Zn, Cu Se (pentru detoxifiere şi îndepărtarea radicalilor liberi), acizi tricarboxilici şi intermediari

Culturile celulare pot fi conservate la temperaturi scăzute (-135°C), după o condiţionare prealabilă şi tratare cu agenţi de crioprotecţie. Congelarea se face progresiv cu o rată de (-1) – (-3)°C pe minut.

Principii de lucru

Vom menţiona aici principiile de urmat şi de evitat în efectuarea şi manipularea unor culturi celulare:
Principii de urmat:

-se foloseşte întotdeauna echipament individual de protecţie (halat, mănuşi, ochelari); opţional se pot folosi mănuşi termoizolante, vizieră şi şorţ special pentru manipularea azotului lichid;

-bonete speciale care să acopere părul strâns;

-echipament special pentru camera de culturi;

-ordinea şi curăţenia pe suprafaţa de lucru

-marcarea corectă a recipienţilor, mediilor, eprubetelor cu conţinutul şi data preparării;

-manipularea unei singure linii celulare o dată. Nu se trece cu un vas pe deasupra altora;

-între operaţiuni, se curăţă masa cu alcool 70% şi se lasă circa 15 minute între manipularea succesivă a

2 linii celulare diferite;

-utilizarea de recipiente separate cu medii pentru diferitele linii celulare;

-examinarea zilnică a culturilor pentru posibile contaminări bacteriene sau fungice;

-controlul de calitate al mediilor şi reactivilor înainte de utilizare (data expirării, pH, contaminare)

-evitarea ambalării în carton a instrumentarului sau culturilor;

-aseptizarea hotei, filtrelor, incubatoarelor, microscoapelor;

-testarea celulelor pentru contaminarea cu Mycoplasma.

De evitat:

-utilizarea de antibiotice în mod continuu, deoarece se ajunge la selectarea unor rezistenţe care fac liniile celulare inutilizabile din punct de vedere comercial;

-acumularea deşeurilor la nivelul zonei de lucru;

-aglomerarea personalului în laborator;

-manipularea celulelor din surse incerte în sistemul principal de lucru; acestea se menţin în carantină până la efectuarea tuturor testelor specifice;

-menţinerea liniilor celulare în cultură continuă, fără recongelare;

-permiterea confluării complete a culturilor; de obicei gradul de confluare este menţionat în protocolul de utilizare al culturii;

-expirarea mediului de cultură; de obicei mediul rezistă 6 săptămâni la 4°C după adăugarea glutaminei şi serului;

-murdărirea băilor de apă;
-decalibrarea echipamentului.

Controlul de calitate

Se vor urmări:

-calitatea reactivilor şi materialelor
o serul fetal bovin nu trebuie să fie infectat cu virusul diareei bovine
o tripsina porcină este sursă de Myocoplasma
o toate materialele trebuie să aibă certificate de calitate la zi; nu se acceptă furnizori neautorizaţi;

-provenienţa şi integritatea liniilor celulare
o liniile celulare să nu fie contaminate
o originea liniilor şi profilul ADN complete
o instrucţiuni de utilizare detaliate

-evitarea contaminării microbiene – sunt posibile 3 tipuri de contaminări:
o bacteriană şi fungică: vizibile prin creşterea bruscă a turbidităţii mediului, modificări de culoare şi pH.

Este necesară examinarea microscopică zilnică cu Mycoplasme (procariote autoreplicative), sub formă de coci sau filamente; efectele contaminării cu Mycoplasma sunt mai insidioase:

o reducerea ratei de creştere a celulelor
o modificări morfologice
o aberaţii cromosomiale
o alterări ale metabolismului acizilor nucleici şi aminoacizilor
o virală: în special pentru serul bovin

loading...
DESCARCA APLICATIA CYD PE MOBIL
Aplicatie CYD Google Play

Nu sunt un artist, nu sunt un talentat scriitor, sunt om ca si tine. Doar ca diferentele dintre mine si tine o fac obiceiurile noastre si viata pe care o traim. Nu ne invartim in aceleasi anturaje, nu avem acelasi limbaj, la dracu nici macar nu ne cunoastem, dar sigur avem de impartit idei sau am avut aceleasi idei o data, desi repet nu ne cunoastem.

Nu te stiu, nu te cunosc, nu te vad, nu te ating, nu te caracterizez, nu te critic, nu te injur, nu te admir, nu te laud, dar tu poti sa ma critici, aplauzi, caracterizezi, poate chiar si sa ma apreciezi. E dreptul tau, e timpul tau.

Latest from Biologie

LIKE-ul tau CONTEAZA!Ti-a placut articolul si ai dat LIKE? Inchide aici
Mergi la Sus

Copyright © 2016 by CYD.RO. Toate drepturile sunt rezervate
Designed by Dianys Media Solutions - realizare site web - creare site web