Stiri Online, Enciclopedie, Revista presei

CRIOFRACTURAREA

in Biologie/Sanatate

Criofracturarea este o metodă folosită în tandem cu procedura de examinare în microscopie electronică.

Metoda constă în fracturarea unei probe biologice congelate. Detaliile expuse prin fracturare (planul de fractură) sunt accentuate prin depunerea unui strat subțire de platină/carbon peste planul de fractură; depunerea stratului are loc sub vid.

Se realizează o replică (copie perfectă negativă), care poate fi examinată în microscopie electronică de transmisie.

Imaginile furnizate de tehnica de criofracturare urmată de examinarea cu ajutorul microscopului electronic de transmisie au schimbat modul de înțelegere a morfologiei funcționale a celulei, deoarece a permis accesul la zone inaccesibile doar prin tehnic de secționare. Este o metodă specială de vizualizare a feţei interne a biomembranelor.

Metodă

Celulele sunt congelate în N2 lichid (-196°C), indirect, într-un sistem bain-marie cu izopentan; piesa este imersată în izopentanul răcit indirect de azotul lichid (fig.2_1). Congelarea are loc în prezenţa unui agent de crioprotecţie pentru a preveni distorsiunile (artefactele) determinate de formarea cristalelor de gheaţă.

Ulterior blocul de gheaţă format este spart cu ajutorul unui cuţit (fig. 2_2, 2_3). În cazul examinării membranelor celulare, planul de fractură traversează adesea planul hidrofob al stratului bilipidic al plasmalemei.

Feţele de fractură rezultate sunt acoperite prin pulverizare sub vid cu un strat subţire de platină-carbon. Stratul de carbon se face prin depunere verticală (fig 2_4). Depunerea platinei se face sub un anumit unghi astfel încât unele zone captează mai mult metal şi determină un aspect „de umbră” sub incidenţa unui fascicul de electroni (fig. 2_5). Se obține o replică de platină-carbon care este curățată și examinată cu ajutorul microscopului electronic de transmisie.

Se obține o replică de platină-carbon care este curățată și examinată cu ajutorul microscopului electronic de transmisie. Curățarea se realizează la presiune atmosferică și temperatura camerei, cu ajutorul unei soluții de hipoclorit de sodiu.

criofracturare

Etapele tehnicii de criofracturare.
2_1: etapa de congelare;
2_2 sistemul de fracturare;
2_3 detaliu asupra fenomenului de fracturare a probei congelate;
2_4 depunerea stratului de platină (vaporizare sub vid, unghi <90°);
2_5 depunerea stratului de carbon (vaporizare sub vid = 90°C)

Detalii privind tehnica de lucru:

1.Congelarea rapidă a pieselor

-metodele clasice presupun o etapă preliminară în care, înainte de congelare, țesutul este fixat în glutaraldehidă după care este imersat în glicerol pentru crioprotecție. Imersia în glicerol împiedică formarea cristalelor de gheață în interiorul probelor; fixare este necesară înainte de tratamentul cu glicerol, deoarece acest reactiv (glicerolul) afectează ultrastructura membranelor celulare;

-pentru congelare, țesutul este imersat rapid (plonjat) într-un agent de congelare (de exemplu, azot lichid sau izopentan răcit in bain marie cu azot lichid);

2.Fracturarea pieselor congelate

-Fracturarea pieselor congelate se realizează de obicei sub vid, prin utilizarea unei lame de microtom răcite în azot lichid; piesa congelată se amplasează pe un suport răcit, apoi se lovește cu lama de microtom răcită și ea în prealabil (fig. 3A).

Pentru probele subțiri putem apela la tehnica de fracturare prin tensiune de forfecare (fig. 3B). Fracturarea unui frotiu de celule care este prea subțire pentru impactarea cu un cuțit sau lamă presupune o metodă derivată din fracturarea prin tensiune de forfecare (fig. 3C)

-Pentru fracturare, se poate utiliza și un dispozitiv articulat care impactează piesa congelată, spărgând-o.

-Dispozitivul de fracturare este diferit în funcție de scopul cercetării și de consistența probei.

3.Realizarea replicii
-Realizare replicii se efectuează în 2 etape: umbrirea și intensificarea.

-Umbrirea se realizează prin depunerea oblică, sub vid, prin vaporizare, a unui strat de platină (care este opac la electroni)

-Imediat după umbrire, se realizează intensificarea, prin depunerea verticală, sub vid, prin vaporizare, a unui strat de carbon, strat care este transparent la electroni (electronii utilizați de microscopul electronic de transmisie – TEM – pentru formarea imaginii)

-Caracteristicile topografice ale suprafeței congelate și fracturate sunt de asemenea convertite în variații de grosime ale replicii (stratului) de platină depus.

4.Curățarea replicii

-După realizarea replicii, proba este adusă la presiune atmosferică şi temperatura camerei. Materialul biologic este îndepărtat prin curăţare cu soluţie de hipoclorit sau acid cromic. Se spală cu apă distilată iar replicile sunt amplasate pe grile de examinare pentru microscopul electronic de transmisie TEM.

5.Rezultate, examinarea replicilor la TEM

O mică parte din replică este amplasată pe o grilă iar examinarea se face la TEM, la măriri diferite. În fig. 4A, imaginea este apreciată cu un microscop binocular simplu, pentru localizarea replicii. Fig. 4B și C prezintă imaginile grilei cu replica depusă, la microscopul electronic de transmisie (TEM) la măriri diferite.

Celule trans-fracturate care prezintă citoplasma (Cyt). Fractura a urmat apoi membranele celulare laterale (PM) pentru două celule adiacente, expunând astfel o joncțiune strânsă (tj) care înconjoară polul latero-apical al celulelor în contact. O parte din joncțiunea strânsă, delimitată de dreptunghiul alb este prezentată mărită, mai jos.

Deoarece linia de fractură trece prin spaţiul extracelular, (ES), rezultă numeroşi cili (c).

DESCARCA APLICATIA CYD PE MOBIL
Aplicatie CYD Google Play

Nu sunt un artist, nu sunt un talentat scriitor, sunt om ca si tine. Doar ca diferentele dintre mine si tine o fac obiceiurile noastre si viata pe care o traim. Nu ne invartim in aceleasi anturaje, nu avem acelasi limbaj, la dracu nici macar nu ne cunoastem, dar sigur avem de impartit idei sau am avut aceleasi idei o data, desi repet nu ne cunoastem. Nu te stiu, nu te cunosc, nu te vad, nu te ating, nu te caracterizez, nu te critic, nu te injur, nu te admir, nu te laud, dar tu poti sa ma critici, aplauzi, caracterizezi, poate chiar si sa ma apreciezi. E dreptul tau, e timpul tau.

Latest from Biologie

LIKE-ul tau CONTEAZA!Ti-a placut articolul si ai dat LIKE? Inchide aici
Mergi la Sus

Copyright © 2016 by CYD.RO. Toate drepturile sunt rezervate
Designed by Dianys Media Solutions - realizare site web - creare site web