Stiri Online, Enciclopedie, Revista presei

IZOLAREA ŞI SORTAREA CELULARĂ

in Biologie/Enciclopedie

Majoritatea tehnicilor de analiză biochimică presupun izolarea celulelor din contextul lor tisular. În acelaşi timp, pentru o analiză cantitativă şi calitativă coerentă, este necesar un număr relativ mare de celule. Dacă pornim investigaţia de la un fragment de ţesut, problema întâmpinată constă în faptul că acest fragment conţine un număr mare de specii celulare amestecate.

Este deci necesară extragerea diferitelor specii celulare urmată de o sortare în funcţie de diferite criterii; dacă numărul de celule este satisfăcător, se poate trece la destructurarea celulară în vederea analizei conţinutului; dacă numărul de celule este insuficient, se poate proceda la multiplicarea acestora în cadrul unor culturi celulare, din care vor fi prelevate mostre pentru o analiză ulterioară.

Izolarea celulară din ţesuturi

Cele mai accesibile ţesuturi animale pentru izolare celulară sunt cele fetale sau neonatale, în care dinamica şi multiplicarea celulară sunt accentuate iar stabilitatea joncţiunilor intercelulare ca şi cantitatea de matrice extracelulară sunt reduse. Desigur, celulele izolate trebuie să-şi păstreze viabilitatea fie că este vorba de o tentativă exploratorie fie că vor fi supuse cultivării ulterioare.

Primul pas în vederea izolării celulare este reprezentat de denaturarea conexiunilor intercelulare şi a liantului reprezentat de matricea extracelulară. Joncţiunile intercelulare sunt dependente de prezenţa ionilor de Ca. Astfel, un chelator (agent de îndepărtare) al calciului cum este EDTA (acid etilen-diamino-tetra-acetic) aplicat fragmentului de ţesut de investigat, va determina desfacerea joncţiunilor menţionate, cu eliberarea celulelor.

Matricea extracelulară (incorect denumită anterior – substanţă fundamentală) poate fi denaturată prin tratamentul fragmentului tisular cu enzime proteolitice ca tripsina sau colagenazele (al căror rol este de a digera componentele ale matricei extracelulare cum ar fi colagenul sau proteoglicanii). După tratarea unui fragment tisular prin tripsinizare (cu tripsină) şi EDTA, de obicei este suficientă o uşoară agitare a eşantionului pentru a disocia celulele viabile. În eprubeta de lucru se obţine o mixtură celulară, formată din celule izolate, în suspensie.

Al doilea pas este separarea şi sortarea celulelor în suspensie, obţinute prin izolarea din ţesuturi. Procedurile de separare implică metode fizice, cum ar fi centrifugarea, care va fi descrisă la metodele de separare a organitelor celulare, pentru care a fost iniţial concepută. Alte proceduri de separare se bazează pe capacitatea celulelor de a adera mai mult sau mai puţin la diferite tipuri de suprafeţe (sticlă sau plastic).

Una din cele mai interesante tehnici de sortare este bazată pe posibilitatea utilizării anticorpilor specifici. Aceşti anticorpi (proteine specifice sintetizate de celulele sistemului imun, ca răspuns la structuri non-self) pot fi ataşaţi la suprafaţa celulelor, în mod diferenţial şi pot interacţiona adeziv cu diferite suporturi organice (colagen, polizaharide, microsfere de plastic.

Aceste suporturi organice formează o suprafaţă de afinitate la care celulele marcate cu anticorpi vor adera. După aderare, celulele pot fi desprinse fie prin agitare uşoară, tratament cu tripsină (tripsinizare) pentru a denatura proteinele care au mediat fenomenele de adezivitate sau tratament cu enzime care denaturează substratul de tip matriceal (colagenul pentru care utilizăm o colagenază).

Una din tehnicile cele mai avansate de sortare a celulelor utilizează cuplarea cu anticorpi urmată de marcajul fluorescent al acestora. Celulele marcate astfel (cu anticorpi marcaţi la rândul lor cu fluoroforul specific) sunt separate de un sistem de sortare prin activarea fluorescenţei. Celulele marcate circulă prin acest sistem de sortare (fig. …) în flux laminar iar fluorescenţa fiecărei celule este măsurată precis. Un subansamblu de sonicare formează picături microscopice care conţin câte o celulă sau nu conţin de loc celule.

Aceste picături microscopice sunt încărcate pozitiv sau negativ în momentul formării, în funcţie de pozitivitatea sau negativitatea fluorescenţei. Apoi, picăturile trec printr-un câmp electric care le deviază traiectoria în funcţie de încărcarea electrică.

Astfel, picăturile cu încărcare pozitivă (şi care conţin celule marcate fluorescent) sunt depozitate într-un recipient fiind separate de cele încărcate negativ. Particulele şi picăturile neîncărcate îşi continuă parcursul în mod gravitaţional, ajungând în recipientul de deşeuri. Astfel de sisteme de sortare au o capacitate de 5000 de celule pe secundă.

Celulele obţinute prin această metodă de sortare pot fi supuse direct analizelor biochimice sau pot fi direcţionate spre alte metode de multiplicare celulară – culturi tisulare şi stabilizarea de linii celulare.

Culturi tisulare şi celulare

Prin definiţie, culturile tisulare reprezintă totalitatea tehnicilor de menţinere şi în unele situaţii de creştere şi multiplicare in vitro a unor mici fragmente tisulare extrase de la plante sau animale. Culturile tisulare sau celulare sunt necesare pentru studiul efectelor unor substanţe endogene sau exogene asupra sistemelor vii. Culturile de ţesut sunt utilizate pentru a iniţia culturi celulare.

Istoric

1881 – Roux a demonstrat viabilitatea celulelor de la embrionul de găină într-o soluţie salină şi în afara unui organism viu

1907 – Harrison rezolvă controversa „doctrinei neuronale” care susţinea că extensiile neuronale se dezvoltă prin evoluţia corpului neuronal şi nu prin fuziunea celulelor care înconjură aceste extensii.

El a cultivat fragmente de măduvă spinală de amfibian (ex. broască) pe cheag limfatic şi a demonstrat că extensiile neuronale se dezvoltă pornind de la corpul neuronal şi invadând suportul nutritiv.

1913 – Carrel demonstrează că unele celule pot creşte şi supravieţui pentru un timp în cultură dacă sunt alimentate corespunzător şi menţinute într-un mediu aseptic.

1948 – Earle şi colab. izolează celule din linia L şi determină formarea de clone celulare în cultură de ţesuturi.

1952 – Gey şi colab. stabilizează prima linie celulară din carcinomul cervical uman, linie cunoscută astăzi sub numele HeLa.

1961 – Hayflick şi Moorehead arată că numeroase fibroblaste mor după un număr determinat de diviziuni în cultură.

1964 – Littlefield introduce mediul HAT în vederea creşterii selective a hibrizilor de celule somatice. Odată cu punerea la punct a tehnicilor de hibridare a celulelor a fost deschisă era manipulării genetice.

1965 – Ham şi colab., a definit un mediu de cultură fără ser pentru celule de la mamifere. Au fost create primele celule hibrid umane-murine (Harris-Watkins).

1975 – Kohler şi Milstein au produs prima dată anticorpi monoclonali din linii celulare compuse din hibridoame.

1976 – Sato şi colab., arată că pentru creşterea celulelor în medii fără ser este necesară prezenţa unor factori de creştere şi hormoni.

Terminologie

Experimentele de cultivare pot avea loc in vitro (ad literam, pe sticlă) sau in vivo, în cadrul unor organisme intacte. Există posibilitatea unor confuzii, mai ales în sens biochimic, deoarece termenul in vitro se referă la reacţii biochimice care au loc în afara celulelor iar termenul in vivo se referă la reacţii care au loc în interiorul unei celule vii.

Noţiunea de cultură celulară se referă la situaţia în care fragmentul de ţesut este disociat în elementele celulare componente; aceste elemente celulare pot prolifera în condiţii fizico-biochimice speciale prestabilite, prin aderarea la un substrat de plastic sau sticlă sau în suspensie în mediul de cultură.

Noţiunea de cultură tisulară a unor fragmente mici este sinonimă cu cea de explant. Menţinerea fragmentelor mici la o interfaţă lichid-solid prin ataşarea tisulară la un substrat de plastic sau de sticlă permite creşterea celulelor pe substrat şi migrarea şi proliferarea celulară ulterioară; poate fi astfel generată o linie celulară.

Noţiunea de cultură de organ presupune ca ţesutul să nu fie disociat ci menţinut la interfaţa lichid-solid; tehnica permite menţinerea arhitecturii tisulare dar nu permite propagarea liniilor celulare în volum.

Aplicaţii

Culturile tisulare sunt utilizate pentru:

-studiul celulelor în micromedii reglate fizic şi fiziologic;

-caracterizarea şi validarea unui stoc de celule;

-minimizarea utilizării animalelor de experienţă;

-studii de transfecţie (introducerea ADN exogen în genomul unor celule izolate şi caracterizate pentru investigarea comportamentului celular şi mutaţiilor);

-inginerie proteică – studiul mecanismelor de semnalizare şi de răspuns celular citotoxic sau genotoxic,
mecanisme sintetice de răspuns la stimuli externi;

Culturile tisulare nu reproduc cu acurateţe condiţiile in vivo datorită diferenţelor de micromediu, absenţei enzimelor hepatice specifice şi dificultăţilor în reproducerea unui fenotip celular complet diferenţiat in vitro. Liniile celulare rezultate din culturi sunt genetic instabile şi heterogene din punct de vedere genotipic.

Clasificare
Culturile pot fi clasificare grosier în:

-culturi primare – derivate direct din fragmente de ţesut sau organ; culturile rezultă fie din explant (fără o etapă iniţială de disociere tisulară) fie după disociere enzimatică într-o suspensie celulară.

-culturi secundare (continue) – rezultate ca urmare a extracţiei celulelor din cultura primară şi cultivări ulterioare; se pleacă de la un singur tip de celule care se multiplică de un număr limitat de ori (de obicei 30 de ori) sau se pot multiplica la infinit. Culturile continue finite constau în celule diploide, cu un grad accentuat de diferenţiere (ex. fibroblaste care continuă să secrete colagen) şi care suferă progresiv procese de senescenţă.

Menţiune: Culturile celulare care se permanentizează presupun o propagare celulară pe o perioadă nedefinită şi, de obicei, se transform în celule tumorale. Celulele tumorale sunt foarte uşor de cultivat şi se obţin fie direct din tumori clinice fie prin inducţie din celule normale prin transfecţia unor oncogene virale sau prin tratamente chimice.

Morfologia celulelor în cultură este variabilă şi denotă de obicei tipul de ţesut din care derivă: liniile celulare derivate din sânge tind să crească în suspensii în timp ce celulele derivate din ţesuturi solide tind să crească în monostrat.

În funcţie de tipul de substrat utilizat, culturile pot fi:
-pe suport organic nutritiv
-pe suport organic nenutritiv
-pe suport anorganic (sticlă, plastic)

Particularităţi şi condiţii
Culturile de celule sunt de obicei preparate într-un spaţiu de lucru steril, special amenajat, izolat prin ecluze de exterior. Acest spaţiu include resurse de apă curentă, gaz electricitate, toate în flux continuu.

Necesarul de bază într-un laborator de culturi de celule este reprezentat de:

-arie de lucru sterilă

-sticlărie, instrumentar specific, sterilizabil sau de unică utilizare (de preferat)

-sisteme de stocare şi congelare

-incubator, sistem de alimentare cu CO2, hotă de flux laminar (în care circulaţia aerului se face numai în direcţie ascendentă

-microscop fotonic pentru controlul culturilor, agitator magnetic, sonicator, balanţă analitică
-consumabile

loading...
DESCARCA APLICATIA CYD PE MOBIL
Aplicatie CYD Google Play

Nu sunt un artist, nu sunt un talentat scriitor, sunt om ca si tine. Doar ca diferentele dintre mine si tine o fac obiceiurile noastre si viata pe care o traim. Nu ne invartim in aceleasi anturaje, nu avem acelasi limbaj, la dracu nici macar nu ne cunoastem, dar sigur avem de impartit idei sau am avut aceleasi idei o data, desi repet nu ne cunoastem. Nu te stiu, nu te cunosc, nu te vad, nu te ating, nu te caracterizez, nu te critic, nu te injur, nu te admir, nu te laud, dar tu poti sa ma critici, aplauzi, caracterizezi, poate chiar si sa ma apreciezi. E dreptul tau, e timpul tau.

Latest from Biologie

LIKE-ul tau CONTEAZA!Ti-a placut articolul si ai dat LIKE? Inchide aici
Mergi la Sus

Copyright © 2016 by CYD.RO. Toate drepturile sunt rezervate
Designed by Dianys Media Solutions - realizare site web - creare site web